蛋白质分子量测定是研究其结构、功能和生物学特性的重要步骤。凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography, GFC），也称为分子排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），是一种基于蛋白质分子大小进行分离和测定的方法。该技术广泛应用于蛋白质纯化、分子量估算以及复合物形成分析。本文将深入探讨凝胶过滤法的基本原理、实验关键点、数据解析以及其在蛋白质分子量测定研究中的实际应用。

一、凝胶过滤法的基本原理

1、工作机制

凝胶过滤色谱通过多孔球形填料（凝胶介质）来分离不同大小的蛋白质分子。当蛋白质样品通过色谱柱时，小分子蛋白可以进入填料的微孔，大分子蛋白由于体积较大难以进入孔洞，从而优先流出色谱柱。

（1）大分子蛋白 → 不能进入填料孔洞，流出速度快，洗脱体积（elution volume, Ve）较小

（2）小分子蛋白 → 能进入填料孔洞，滞留时间较长，洗脱体积较大

这种基于分子大小的分离方式，使得凝胶过滤不仅可用于蛋白质纯化，还能用于蛋白质分子量测定。

2、关键参数

（1）体积参数

* 柱体积（Vt）：整个色谱柱的总体积

• 柱空隙体积（Vo）：大分子完全排除填料孔洞时的洗脱体积（通常通过蓝色葡聚糖等大分子物质测定）
• 洗脱体积（Ve）：目标蛋白洗脱的体积
• 相对洗脱体积（Kav）：用于计算蛋白质的分子量

（2）凝胶填料

* 主要由葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、聚丙烯酰胺（Bio-Gel）或硅胶基质组成。

• 选择合适的填料孔径范围，确保目标蛋白可以有效分离。

二、凝胶过滤法蛋白质分子量测定的实验关键点

1、选择合适的凝胶填料

（1）填料孔径（Fractionation Range）：应与目标蛋白的分子量匹配。例如：

• Sephadex G-75（适用于 3-70 kDa）
• Superdex 200（适用于 10-600 kDa）

（2）若蛋白质分子量远小于或大于填料适用范围，则分离效果会降低。

2、校准标准曲线

采用一系列已知分子量的标准蛋白进行校准，绘制标准曲线：

其中，MW 是分子量，Kav 由实验测得。通过标准曲线推算未知蛋白的分子量。

3、样品制备

（1）样品需彻底溶解，无沉淀或聚集体，避免堵塞色谱柱。

（2）适当过滤或离心去除颗粒杂质。

（3）添加 DTT 或 β-巯基乙醇 以破坏二硫键，防止蛋白质聚集。

4、实验条件

（1）流速：通常较低（0、2-1 mL/min），避免流速过快导致分辨率下降。

（2）缓冲液：需适配蛋白性质，如 PBS、Tris-HCl、Hepes 等，防止蛋白变性或聚集。

（3）温度控制：低温（如 4°C）可减少蛋白降解。

5、数据分析

（1）记录蛋白洗脱峰（UV 280 nm），确定 Ve 值。

（2）将 Ve 代入标准曲线计算蛋白分子量。

（3）若蛋白出现多个峰，可能存在二聚体、聚集体或蛋白复合物。

三、凝胶过滤法蛋白质分子量测定的实际应用

1、 估算天然蛋白质的分子量

由于SDS-PAGE 仅能测定变性蛋白的表观分子量，凝胶过滤可用于测定天然状态下的分子量，确认蛋白是否为单体、二聚体或更高聚体。例如，单体蛋白在 SDS-PAGE 上显示 30 kDa，但在凝胶过滤中出现 60 kDa 峰，提示其可能为二聚体。

2、 蛋白质复合物的分析

研究蛋白质是否与其他分子结合形成复合物。例如：

（1）核酸结合蛋白的分子量增加，提示其与 DNA/RNA 结合。

（2）免疫复合物的大小变化，反映抗原-抗体相互作用。

3、 蛋白质纯度和聚集体检测

在生物制药和蛋白药物开发中，检测蛋白聚集体 是关键步骤，因聚集体可能影响蛋白功能或导致免疫原性。

4、 监测蛋白质构象变化

某些蛋白质在不同 pH、温度或离子浓度下会发生构象变化，导致分子量变化。例如，某些伴侣蛋白（如 Hsp70） 在 ATP 存在与否时可能形成不同的寡聚体状态，凝胶过滤可用于监测这一变化。

四、凝胶过滤法的优势与局限性

1、优势

（1）温和分离，不破坏蛋白质天然结构，适用于天然蛋白的分子量测定。

（2）高分辨率，可区分不同聚集状态的蛋白，如单体、二聚体、四聚体等。

（3）适用于大分子复合物分析，可用于研究蛋白-蛋白、蛋白-核酸相互作用。

（4）可与 HPLC、FPLC 结合，提高分离效率。

2、局限性

（1）精度低于质谱，仅提供近似分子量，无法获得精确的氨基酸序列信息。

（2）样品要求高，蛋白质必须保持稳定，避免聚集或沉淀。

（3）难以分辨相似大小蛋白，若两种蛋白的分子量相近，分离效果有限。

凝胶过滤色谱（SEC）广泛应用于蛋白质的分子量测定、复合物分析、聚集体检测和构象研究。尽管其精度不及质谱，但其温和、非变性的分离方式使其成为研究天然蛋白质状态的重要工具。随着新型填料和自动化技术的进步，如高分辨 SEC-HPLC 和多角度光散射（MALS） 结合使用，凝胶过滤在蛋白质分析中的应用将进一步拓展，为生物医药、蛋白组学和结构生物学研究提供更强有力的支持。百泰派克生物科技一直致力于为客户提供高质量的蛋白质分子量测定服务，采用先进的凝胶过滤方法，精准测量蛋白质分子量，为您的研究提供可靠的数据支持。如需了解更多关于蛋白质分子量测定：凝胶过滤方法、关键点和实际应用的信息，欢迎与我们合作，共同推动科研进步。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

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