新型双压线性离子阱质谱仪给蛋白质组学带来革命性变化

Tonya Pekar Second, Justin Blethrow, Jae C. Schwartz, Vlad Zabrouskov, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA

关键词：

LTQ Velos  线性离子阱，蛋白质学，蛋白鉴定，肽测序、灵敏度、蛋白质组发现者

引言：

对于一个蛋白质组全面的了解是研究动态蛋白质组的基础。蛋白质的鉴定是需要有效、稳定可靠的方法。串联质谱尤其是线性离子阱和基于阱的杂交质谱仪日益成为肽段和蛋白质鉴定的首选。选择此类仪器的主要原因在于该类仪器具有良好的稳定性、重现性、易用性以及良好的一级和二级谱图质量。

在一个蛋白质组体系里，经常会存在一些低丰度不易被质谱仪鉴定到的蛋白，其中某些蛋白还会存在一些动态修饰，就更难被仪器检测到。因此，需要发展更先进灵敏度更高的一切来应对复杂蛋白质组蛋白鉴定的需求。

本篇应用论文主要介绍了用新型双压线性离子阱质谱仪分析复杂、Caenorbabditis elgans(C.elegans)的肽段混合物。比较了新型双压线性离子阱质谱仪与线性离子阱和广泛应用的四级杆-飞行时间质谱仪的性能。

仪器创新

在本篇文章主要测试Thermo Scientific 的LTQ Velos离子阱质谱仪。它包括了一个新型双压线性离子阱和高压环形离子导入装置（S-Lens），如图1所示。

S-lens的射频显著提高了离子注入到质谱仪中，这降低了在线性离子阱中离子累积所需要的时间。

双压阱的第一个池的压力比以前线性离子阱的压力要高，大约在5×10-3Torr，这能够显著提高目标离子的捕获效率、分离效率和碎裂效率。提高的分离效率显著降低了前体离子所需要的时间，所需时间是从前的四分之一。LTQ Velos离子阱对于在有高丰度干扰离子背景下低丰度前体离子具有较好的选择性，提高了二级质谱分析的动态范围。高压也缩短了碰撞诱导解离所需的时间的67%，同时保持了同样的碎裂效率。第二个池保持较低的压力，大约在4×10-4Torr，可以以较高的分辨率进行快速质量分析。

高捕获效率

高裂解效率

高分离效率

5×10-3  氦气

高分辨率、扫描速度

3.5×10-4  氦气

图一 LTQ Velos 质谱仪，高压环形离子导入装置（S-Lens）和新型双压线性离子阱（不同压力控制）

与新型双压线性离子阱协力合作，在典型的数据依赖模式的串联质谱实验中，在阱里一种新型控制离子累积的方法能显著提高实际的扫描速率。这个功能叫做“预测AGC”，去除了每一次串联质谱扫描所做的预扫，基于离子流出和前一次一级质谱全扫描的母离子的相对强度，预测了离子累积所需要的时间。

实验

样品制备

C.elgans匀浆液的可溶性部分用pH7.8的碳酸氢铵稀释，加入0.1%的RapiGest表面活性剂，解释用二硫苏糖醇在100℃还原二硫键，并用碘乙酰胺对半胱氨酸烷基化。样品解释用对K/R特异性酶酶切4个小时。酶解物质酸化后存放至-80℃。在进入反相高效液相色谱-串联质谱前用0.1%的甲酸稀释。

液相色谱-串联质谱分析

为了比较和评估性能，在Thermo Scientific的LTQ XL线性离子阱质谱仪和安捷伦6520四级杆-飞行时间质谱仪一级LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪对C.elegans的蛋白酶解物进行了分析，肽段混合物是在反相色谱进行分离的。详细的色谱条件请参照表1。同时对减少进样量进行了考察。

在所有实验中，均采用数据依赖的串联质谱采集方法。在每一台仪器上至少运行3次样品。

对于线性离子阱的数据依赖模式检测方法，该方法主要分析十个最强的离子，根据色谱峰的峰宽，优化排除条件，色谱峰的峰宽主要是根据反相梯度长度变化。由于在LTQ Velos质谱仪离子源有较好的离子传输，因此一级质谱全扫描需要较低的最大注射时间。在进行二级质谱扫描的时候，可用同样的最大注射时间，这样可以捕获更多的例子，进而鉴定得到低丰度的肽段（前体离子丰度较低，AGC的注射时间达到最大）。在LTQ Velos前体离子的选择上采用数据依赖的模式，对一级质谱信号设置更高的阈值。离子转移管的温度为250℃，比LTQ XL更高，目的是补偿短的毛细管长度。碰撞诱导解离的时间从30ms降至10ms，充分利用更高的压力池，提高碎裂效率。LTQ Velos双压离子阱对于正常扫描模式同时提供了碎裂效率和扫描速率，而且阻止了单电荷的前体离子的传输。在数据采集模式充分利用了这个特点，详细的采集参数如表2所示。

6520四级杆飞行时间质谱仪（Q-TOF）的采集参数如表3所示。采用了3Hz和6Hz的扫描速率，以最大化实现对肽段进行鉴定，实际有效的扫描速率为2.5Hz或5.1Hz。参数设置参考了安捷伦的技术支持，同时也与推荐文献报道相类似。

数据库搜索

通过用Thermo Scientific蛋白质组学发现1.0（Proteome Discovery)软件和英国伦敦Matrix Sciences公司的Mascot2.1搜索引擎对数据进行检索，比较离子阱和四级杆-飞行时间质谱仪所采集的数据。用于数据库搜索的条件如表4所示。在Mascot中选中反相库检索选项，对所有的数据进行过滤，保证1%或更低的的假阳性率。用安捷伦的软件Masshunter将6520的四级杆-飞行时间质谱仪所采集的数据转换为mzdata格式，然后提交到蛋白质组学发现（Proteome Discovery)软件。Proteome Discovery软件会自动计算期望得分（或肽得分，如果选中的话）来过滤数据，达到满足特定的假阳性率，然后将该过滤方法应用到数据集中。

因此，选择高置信度的肽段过滤条件来使最终检测到的蛋白满足1%或更低的的假阳性率。将数据库检索得到的特异性肽段的数量和蛋白数进行比较。

表1 肽段一维反相色谱分离条件

表2： LTQ Velos and LTQ XL 质谱