基因功能缺失是研究基因功能的常用方法之一，当前主要通过RNAi或者Crispr/cas9两种途径实现。这两大技术已经发展完善，应用极其广阔，但即便针对人区区两万个基因，也没有一家公司能够提供100%有效的商业化靶点，换言之，基因的knockdown或者knockout不是那么简单的。为何呢？
当前靶点敲低的现状
首先，我们梳理下两大技术的商业化产品类型，先说国外的，RNAi以sigma为例，其官网针对每个基因提供六个靶点的产品，同样，张锋的cas9文库同样针对每个基因设计六个靶点；国内的绝大多数提供该产品的公司，都是设计3~5个靶点，才承诺一个靶点在RNA水平有敲低效果。
说到底，无论哪种下调技术，都无法保证设计的靶点一定是有效的，所以才需要同时设计多个，通过验证，找出有效的那个。看到这，你或许有疑问：明明靶点就是针对基因设计的，为何还无效呢？因为靶点的有效性受限于众多因素，以RNAi为例，影响靶点的因素包括：
（1）基因的表达水平：表达越低，敲减越难；
（2）RNA的二级结构：RNA本身是单链的，其序列某些区域可能互补，靶点就无法结合；
（3）载体结构：不同骨架的载体，表达shRNA的水平是有差异的；
（4）细胞系差异：同一个靶点，在不同细胞的敲减效率是有差异的；
当然，影响靶点有效性的因素不单单包含上面的4点，我们常常碰到，同一个靶点感染同一种类型的细胞，效率都有差异，这就很魔幻了，无法解释啊。所以，生物类的实验重复率低嘛，当你兴冲冲查到一个高分文献的有效靶点，并定制，最后验证无效，不要怀疑，不是别人造假，这也是正常现象。而cas9受限于基因组上SNP等因素的影响，即便验证出有效靶点，换个细胞，也可能因为靶点刚好在SNP上而无效。
说了这么多，小编不是在贩卖焦虑，而是说明了做基因功能缺失的难处，当然，是本着支招的目的去的，有没有可尝试的手段呢？那就是今天要分享的文献，多靶点串联用于基因下调。前面我们讲了，设计一个靶点可能是无效的，那就设计多个靶点，同时验证，等于做多个备胎，但如果将多个靶点构建在一起呢，不就省略了验证多个的情况吗，效果会好吗？
新思路-多靶点串联验证
Weng1等人针对红色荧光设计了三个靶点，分别构建进入U6启动子的载体，同时构建了一个三个靶点串联在一起的载体，并转入带有红色荧光的细胞：
随后，作者从荧光强度、RNA水平表达活性、WB水平表达程度三个维度分析，发现三个靶点串联的DsRed-3shRNA下调基因的水平都优于三个单独的shRNA，证实了，多靶点串联的优越性：
dsRed是外源转入细胞并敲低的，那针对内源性基因，敲低效果如何呢？作者选择卵巢癌细胞高表达的Akt2 作为靶标，设计单个靶点、双靶点串联、三靶点串联的三种病毒组合，分别感染细胞，结果如下：
若要在同一个细胞中同时下调多个基因，若采取单靶点构建形式，势必要转入多个载体，这无疑会加大实验操作难度，因为不同的载体都需要筛选，费时费力。Fink2等人采取多靶点串联构建策略，针对不同基因设计靶点串联构建，与单靶点构建做对比，同样证实前者的有效性：
上述针对不同基因设计靶点串联构建的形式，在动物水平应用更加广泛。因为单只动物，其某一部位，注射的病毒量、体积都是受限的，若要同时操作多个基因，难度更大，而多靶点串联对于基因下调则是优选，Platt3等人使用单个aav病毒，运用cas9的方式敲除肺腺癌中前三个显着突变的基因KRAS、p53和LKB1，从而建立了疾病模型：
你看，同时敲三个基因，只需要一个病毒即可，是不是很省钱，很有效呢？
总 结
串联构建法对于基因的下调是很有利的，那为啥不如单个靶点使用广泛呢？构建单靶点，成本低、构建快；但是多靶点串联，其成本很高，周期也较长，也不能100%保证有效，所以限制了其发展。但对于动物实验者，若没有有效靶点，又没条件筛选的话，串联不失为最佳的选择，总比随意设计一条碰运气要强很多。
吉凯基因有丰富的靶点设计经验，及提供众多形式的筛靶服务，当然，也提供靶点串联方案的设计，想尝试的，受困于无有效靶点的你，还在等什么，赶紧来尝试吧！！！
【参考文献】
1.A multi-shRNA vector enhances the silencing efficiency of exogenous and endogenous genes in human cells
2.A simple approach for multi-targeted shRNA-mediated inducible knockdowns using Sleeping Beauty vectors
3.CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling