在miRNA 的研究中经常会涉及到miRNA 与基因靶向关系的验证，miRNA 通过其种子序列（5’端第2-8 个碱基）靶向结合mRNA 的3’UTR 区，诱导细胞内沉默复合体介导的mRNA降解或阻遏mRNA 的翻译过程。基于以上原理，如图，将目的基因3'UTR 区（或结合位点下游500bp）插入到荧光素酶报告基因载体luciferase 下游，与miRNA mimics 共转染目的细胞，加入底物，检测荧光素酶活性的变化。若荧光素酶活性下调，则该miRNA 与靶基因3'UTR 区存在相互作用。

常用载体：PGL3-CMV-LUC-MCS

图1.miRNA与3‘UTR报告基因原理示意图

双荧光素酶报告基因检测用于验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用的工作原理主要基于以下几个步骤：

miRNA靶基因的生物信息学预测

利用生物信息学分析软件（如TargetScan、StarBase和miRanda等）来分析特定靶基因的3'-UTR区序列是否有miRNA结合位点。

  构建报告基因载体

将预测能够与miRNA结合的靶基因3'-UTR序列插入载体中萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）的3'-UTR。当miRNA和质粒中的插入序列结合后，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光素酶的翻译，最终造成荧光值的降低。

miRNA/靶基因间相互作用的结构学验证

通过双荧光素酶报告基因实验可以理解为通过荧光值来判断miRNA是否与靶基因结合。如果miRNA与插入到质粒中的目标序列发生结合，miRNA将通过抑制该序列的翻译来降低萤火虫荧光素酶的表达，进而导致荧光强度的下降。这一变化可以作为miRNA与靶基因结合的指标。  

miRNA与靶基因的作用机制

miRNA的基本作用机制有两种：抑制蛋白翻译和通过不完全的miRNA-mRNA互补配对诱导靶RNA降解。miRNA通常与mRNA的3'UTR区域发生结合，通过这种方式发挥其生物学功能。  

实验步骤

构建含靶基因3'UTR的双荧光素酶报告基因载体，合成miRNA mimics和miRNA negative control，将载体和miRNA共转染到细胞中，最后进行双荧光素酶检测以确定目的miRNA的靶基因。  

结果分析

实验中，如果miRNA能够与靶基因结合，荧光值会显著性下降。如果结合位点发生突变，miRNA无法与突变后的靶基因结合，荧光值与未突变的对照组无显著性差异，从而验证miRNA与靶基因的结合位点。

通过上述步骤，双荧光素酶报告基因检测可以有效地验证miRNA与靶基因3'UTR的相互作用，为研究miRNA的功能和调控网络提供重要工具。

翌圣双荧光素酶报告基因检测服务流程：

详细操作步骤：

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材料与准备

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细胞HEK 293 细胞或指定目的细胞

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转染试剂：可选Hieff Trans® in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent转染试剂（货号：40806ES）

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报告基因检测试剂盒：Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit 双萤光素酶报告基因检测试剂盒（货号：11402ES）

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其他仪器耗材酶标仪、细胞培养板等

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实验步骤

  01 

目的细胞质粒瞬转预实验

当选择在目的细胞（而非293 工具细胞）中进行验证实验时，首先要确认目的细胞的质粒瞬转效率，以及摸索合适的瞬转体系，质粒瞬转效率>40%以上时表明预实验通过。

02 

转染正式实验

a. 将状态良好，处于对数生长期的空白细胞用0.25%胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，接种于24 孔培养板中；

b. 培养过夜，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率70%左右时，进行转染实验；

c. 转染2 h 前换液为新鲜的培养基；

d. 转染取无菌的1.5 mL EP 管，转染参考转染试剂使用说明书；

e. 转染48 h 后收集细胞样品。

03 报告基因检测

A 细胞样品收集

a. 转染后从培养箱中取靶细胞，轻轻吸净培养液，PBS 洗涤2 次；

b. 弃去PBS，每孔加入100 μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用无菌水稀释而得）；

c. 细胞裂解后，将样品转移入EP 管中，-80 度冰箱保存。

B 根据报告基因检测试剂盒说明书操作进行检测

a. 将充分裂解后的裂解产物，10,000-15,000 rpm 离心3-5 min。离心后将上清液移入新的

EP 管进行后续检测。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照样品要求的量，将Renilla Luciferase Assay

Reagent(100×)按照稀释比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混匀后室温放置。

c. 荧光素酶检测

按照仪器说明书要求将荧光检测打开，设定参数，测定时间为10 s，测定间隔为2 s；

将样品按照20 μL 的体积加入测量管中（保持每次样品的加样量一致），

另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混匀2-3 次（不能漩涡混匀），充分混匀后

测定RLU（Relative light unit），同时设置Cell Lysis buffer 为空白对照孔；

将检测后的样品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混匀2-3 次，充分

混匀后测定RLU，同时设置Renilla Luciferase Assay 工作液为空白对照孔。

04 数据处理与分析，计算相对荧光强度

05 提供原始数据及完整性实验报告

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常规检测分组

（1）mimics NC+对照质粒+海肾内参（TK)；

（2）mimics NC+ 3’UTR 野生型质粒+海肾内参（TK）；

（3）mimics NC+ 3’UTR 突变型质粒+海肾内参（TK)；

（4）mimics+对照质粒+海肾内参（TK)；

（5）mimics+3’UTR 野生型质粒（WT）+海肾内参（TK)；

（6）mimics+3’UTR 突变型质粒（MT）+海肾内参（TK)。

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实验预期结果

翌圣可提供双荧光素酶报告基因检测服务，加快基础研究及药物筛选进度

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